Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe jako biomarkery odpowiedzi na immunoterapię w NSCLC

Czy EVs zmienią podejście do leczenia NSCLC?

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe jako biomarkery odpowiedzi na immunoterapię w zaawansowanym niedrobnokomórkowym raku płuca – przełomowe odkrycie dla personalizacji leczenia

Rak płuca, mimo że jest drugim najczęściej diagnozowanym nowotworem (11,4% wszystkich przypadków), pozostaje główną przyczyną zgonów z powodu chorób nowotworowych (18% wszystkich zgonów). Szczególnym wyzwaniem jest niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC), którego diagnostyka we wczesnym stadium dotyczy zaledwie około 20% pacjentów. Większość chorych diagnozowana jest w zaawansowanych stadiach (IIIB/IV), gdy nowotwór zdążył już rozprzestrzenić się do węzłów chłonnych i/lub odległych narządów, co znacząco pogarsza rokowanie.

Przełomem w leczeniu zaawansowanego NSCLC stały się inhibitory punktów kontrolnych układu immunologicznego (ICI), szczególnie przeciwciała monoklonalne ukierunkowane na PD-1 lub jego ligand (PD-L1), w tym pembrolizumab. Leki te przywracają przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną, znacząco wydłużając przeżycie pacjentów. Niestety, nie wszyscy chorzy odpowiadają na tę terapię, a niektórzy doświadczają działań niepożądanych związanych z układem immunologicznym.

Choć ekspresja PD-L1 w guzie pozostaje głównym biomarkerem stosowanym w praktyce klinicznej do kwalifikacji do terapii ICI, niektórzy pacjenci z wysoką ekspresją PD-L1 nie odnoszą korzyści z leczenia, podobnie jak część chorych z niską lub nawet ujemną ekspresją PD-L1 może na nie zareagować. Ponadto, standardowa biopsja guza nie odzwierciedla w pełni heterogenności molekularnej i przestrzennej nowotworu oraz dynamicznej relacji między guzem a gospodarzem.

Nadzieją na przezwyciężenie tych ograniczeń jest analiza biomarkerów krążących, w tym pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs). “Biopsja płynna oparta na pęcherzykach zewnątrzkomórkowych wyłania się jako innowacyjne i nieinwazyjne podejście w diagnostyce nowotworów, pozwalające przezwyciężyć ograniczenia konwencjonalnej biopsji guza” – piszą autorzy badania opublikowanego na łamach Frontiers in Immunology.

Jak badanie EV odsłania tajemnice mikroRNA?

EVs to małe cząstki otoczone podwójną warstwą lipidową o średnicy 30 nm-1 μm, uwalniane przez wszystkie typy komórek zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patologicznych. Obecne we wszystkich płynach biologicznych, chronią swoją zawartość (RNA, DNA, białka i metabolity) przed degradacją. Badacze postawili hipotezę, że niektóre mikroRNA (miRNA) związane z NSCLC mogą odgrywać rolę w odpowiedzi na terapię i być powiązane z rokowaniem oraz odpowiedzią na leczenie pierwszej linii pembrolizumabem u pacjentów z NSCLC z ekspresją PD-L1 ≥50%.

W badaniu przeprowadzonym w IRCCS CROB we Włoszech uczestniczyło 21 pacjentów z zaawansowanym NSCLC, u których przed rozpoczęciem leczenia pembrolizumabem w monoterapii pobrano próbki surowicy. Pacjenci byli obserwowani do marca 2024 roku. Na podstawie oceny radiologicznej 6 miesięcy po rozpoczęciu terapii, zgodnie z kryteriami RECIST, pacjentów sklasyfikowano jako odpowiadających na leczenie (R) – jeśli wykazywali stabilizację choroby lub częściową/całkowitą odpowiedź, lub nieodpowiadających (NR) – jeśli nastąpiła progresja choroby.

Wśród badanych pacjentów było 13 mężczyzn i 8 kobiet, a ich mediana wieku wynosiła 67 lat (zakres 47-80 lat). Większość pacjentów (n=16) stanowili palacze, a tylko jeden był niepalący. Klasyfikując pacjentów na podstawie skali sprawności Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG PS), większość (n=11) miała ECOG PS 1, natomiast po 5 pacjentów miało ECOG PS 0 i ECOG PS 2. W badanej kohorcie gruczolakorak był najczęstszym typem histologicznym (n=16) w porównaniu do raka płaskonabłonkowego (n=5). Wszyscy pacjenci mieli różne przerzuty w momencie diagnozy, z medianą 2 miejsc przerzutowych (zakres 1-4).

Badacze wyizolowali z surowicy krążące pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (cEVs) i przeanalizowali ich zawartość pod kątem 12 wybranych miRNA: miR-10a, miR-21, miR-22, miR-30a, miR-34a, miR-106b, miR-125b, miR-150, miR-155, miR-181a, miR-181b i miR-451a. Wybór tych konkretnych miRNA podyktowany był ich udokumentowanym udziałem w NSCLC oraz potencjalną rolą jako biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych.

Do izolacji cEVs z surowicy wykorzystano ustaloną wcześniej metodologię, a następnie przeprowadzono szczegółową charakterystykę wyizolowanych pęcherzyków. Zgodnie z wytycznymi MISEV 2023, proces ten pozwolił na izolację cEVs, które są okrągłe, heterogenne, wzbogacone w małe EVs i, co ważne, wolne od zanieczyszczeń surowiczych. Ta ostatnia cecha jest istotna dla wiarygodności późniejszej analizy EV, na przykład poprzez wykluczenie miRNA związanych z wolnymi białkami.

Wyniki badania wykazały, że stężenie cEVs było znacząco wyższe u pacjentów z zaawansowanym NSCLC w porównaniu do zdrowych ochotników (mediana 10,3×10⁸ cEVs/ml vs 7,1×10⁸ cEVs/ml, p=0,009). Analiza wielkości wykazała, że cEVs od pacjentów z NSCLC miały większe rozmiary niż te od zdrowych dawców, co sugeruje, że choroba nowotworowa wpływa nie tylko na liczbę, ale także na charakterystykę uwalnianych pęcherzyków.

Najciekawsze wyniki dotyczyły jednak zawartości miRNA w cEVs. Wszystkie 12 badanych miRNA wykryto w cEVs pacjentów z NSCLC, przy czym miR-451a, miR-21 i miR-30a występowały w największych ilościach. Co istotne, ekspresja miR-181b była statystycznie istotnie wyższa u pacjentów nieodpowiadających na leczenie w porównaniu do odpowiadających (mediana 790 vs 280 kopii/μl, p=0,02).

Podobny trend zaobserwowano dla miR-106b i miR-451a, których poziomy były również wyższe u pacjentów NR w porównaniu do R. Co więcej, analiza krzywych przeżycia Kaplana-Meiera wykazała, że pacjenci z niską ekspresją miR-181b, miR-106b i miR-451a mieli znacząco dłuższy czas przeżycia wolny od progresji (PFS) w porównaniu do tych z wysoką ekspresją tych miRNA (mediana PFS: 17 vs 3,5 miesiąca, p=0,0016 dla miR-181b; 17 vs 4 miesiące, p=0,007 dla miR-106b; 17 vs 4 miesiące, p=0,02 dla miR-451a).

Badacze przeprowadzili również analizę systematyczną genów docelowych dla badanych miRNA przy użyciu platformy miRTargetLink 2.0, identyfikując 1387 celów. Aby przeprowadzić rygorystyczną analizę, skupili się na 24 celach, które były wspólne dla większej liczby miRNA. W szczególności, miR-21, miR-34a, miR-125b, miR-181a/b i miR-451a wspólnie celowały w BCL2, podczas gdy miR-10a, miR-21, miR-106b, miR-155 i miR-181a/b celowały w PTEN. Ponadto, kombinacja czterech miRNA celowała w FOS, TP53 i STAT3, a kombinacja trzech miRNA celowała w inne mRNA.

Analiza wzbogacenia ontologii genów tych 24 celów wykazała “Nowotwór”, w tym NSCLC, jako najbardziej wzbogacony termin KEGG. Mapy sygnalizacyjne Panther i Reactome ujawniły, że prawie wszystkie cele zbiegały się w szlakach IGF, P53, VEGF, NOTCH i PI3k. Dodatkowo zidentyfikowano ich zaangażowanie w sygnalizację interleukin, w tym IL-4, IL-13, IL-5, IL-2, IL-7, oraz w regulację komórek immunologicznych, takich jak limfocyty T i B, w bazach danych Reactome i WikiPathways.

Szczególnie interesujące wyniki uzyskano w podgrupie pacjentów z gruczolakorakiem płuca (n=16). W tej grupie miR-181b nadal wykazywał zdolność różnicowania między R i NR, a dodatkowo ekspresja miR-106b, miR-451a, miR-10a i miR-181a była znacząco wyższa u pacjentów NR w porównaniu do R.

Czy biomarkery EV przewidują leczenie i rokowanie?

W kontekście gruczolakoraka, sześć miRNA wykazało korelację z PFS, a tylko jedno z OS. W szczególności, wyższe ekspresje miR-181b (p=0,07), miR-106b (p=0,009), miR-451a (p=0,02), miR-10a (p=0,07), miR-22 (p=0,02) i miR-34a (p=0,05) skutkowały krótszym PFS. Co ciekawe, miR-106b wyróżniał się również korelacją z OS. Pacjenci z gruczolakorakiem z niską ekspresją miR-106b w momencie diagnozy mieli znacząco dłuższy OS w porównaniu do pacjentów z wysoką ekspresją (p=0,069; mediana OS 29 vs 8 miesięcy). Współczynnik ryzyka (HR) wynoszący 0,3427 wskazuje na niskie ryzyko zgonu przy niskim poziomie ekspresji miRNA w porównaniu do wyższej ekspresji.

Czy poziomy miRNA mogą być związane z występowaniem przerzutów? Badacze wykazali, że miR-106b i miR-451a były znacząco wyższe u pacjentów z 3-4 miejscami przerzutów w porównaniu do pacjentów z 1-2 miejscami. Co ciekawe, oba te miRNA były bardziej obfite u pacjentów z przerzutami do kości w porównaniu do innych typów przerzutów.

Autorzy badania podkreślają, że cEVs i ich zawartość miRNA są uwalniane przez wszystkie komórki organizmu, które “cierpią” z powodu stanu przerzutowego, sugerując, że miRNA EV współregulują przerzutowy NSCLC i jego komunikację z innymi komórkami, szczególnie z komórkami immunologicznymi, zarówno lokalnie, jak i w odległych miejscach.

Dane wykazały, że miR-106b, miR-181b i miR-451a były w stanie rozróżnić pacjentów odpowiadających i nieodpowiadających na pembrolizumab z wysoką dokładnością. Według wiedzy autorów, nie było wcześniejszych dowodów pokazujących te cEV-miRNA i ich związek z odpowiedzią na immunoterapię. Niektóre informacje dotyczą ich obecności jako wolnej formy w krążeniu.

W szczególności, wolne miR-106 i miR-181 w surowicy były podwyższone u pacjentów odpowiadających w porównaniu do nieodpowiadających, a ich ekspresja u odpowiadających wzrosła od stanu przed terapią do stanu po terapii u wielokrotnie leczonych pacjentów z NSCLC przed terapią niwolumabem. Jeśli chodzi o cEVs i odpowiedź na immunoterapię, Peng i wsp. zidentyfikowali klaster miRNA w egzosomach osocza (miR-320), który korelował z niekorzystną odpowiedzią na leczenie anty-PD-1 u wielokrotnie leczonych pacjentów z NSCLC.

Szczególnie interesujący jest wynik dotyczący miR-106b, który wykazał HR wynoszący 0,34 dla OS. Oznacza to, że pacjenci z NSCLC z niskim miR-106b będą mieli 66% redukcji wskaźnika śmiertelności (tj. czas do śmiertelności jest wolniejszy), podczas gdy ci z wyższymi poziomami miR-106b będą mieli 34% wzrost wskaźnika śmiertelności. HR wskazuje wskaźnik ryzyka zdarzenia będącego przedmiotem zainteresowania w następnym przedziale wśród osób, które jeszcze nie doświadczyły zdarzenia. Dlatego jest on klinicznie istotny, ponieważ określa ilościowo efekt leczenia (w tym przypadku pembrolizumabem) w czasie do określonego zdarzenia, takiego jak zgon.

Badacze zwracają również uwagę na rolę miR-181a/b, które są związane z szerokim zakresem patologii, w tym nowotworów, celując w kluczowe geny zaangażowane w unikanie supresji wzrostu lub oporność na śmierć komórkową, oraz są regulatorami angiogenezy, inwazji i przerzutów. Niedawno Junliang Ma i wsp. donieśli, że miR-181b był podwyższony w egzosomach pochodzących z surowicy i komórek pacjentów z NSCLC. Poziomy ekspresji miR-181a/b w raku płuca są związane z cechami kliniczno-patologicznymi, takimi jak wskaźnik przeżycia pacjentów, stopniowanie TNM i oporność na leki.

Jeśli chodzi o miR-451a, który okazał się najbardziej obfitym miRNA w cEVs NSCLC, donoszono, że jego niska ekspresja była związana z krótszym OS. Ponadto, egzosomalny miR-451a osocza został zidentyfikowany jako biomarker do przewidywania nawrotu i rokowania u pacjentów z NSCLC w stadium I-III.

Jak wprowadzić EV biomarkery do codziennej praktyki klinicznej?

“Nasze badanie dostarcza pierwszy dowód koncepcyjny, że miRNA z surowiczych cEV, w kohorcie pacjentów z zaawansowanym NSCLC z wysoką ekspresją PD-L1, mogą być nowymi biomarkerami do diagnostyki NSCLC, do przewidywania odpowiedzi na pembrolizumab, do prognozowania zarówno PFS, jak i OS, oraz do badania przerzutów” – podsumowują autorzy badania.

Odkrycie to może mieć ogromne znaczenie dla personalizacji leczenia pacjentów z NSCLC. Biopsja płynna oparta na analizie cEVs i ich zawartości miRNA oferuje szereg zalet w porównaniu z tradycyjnymi biopsjami tkankowymi. Po pierwsze, biopsje tkankowe mogą nie odzwierciedlać kompleksowej sytuacji choroby ze względu na heterogenność guza, podczas gdy biopsje płynne mogą pomóc w zapewnieniu ogólnej oceny. Po drugie, wraz z postępem w praktyce klinicznej, biopsje płynne cEV mogą znacznie zmniejszyć liczbę inwazyjnych biopsji.

Jak te odkrycia mogą wpłynąć na codzienną praktykę kliniczną? Biomarkery oparte na cEV mogłyby zostać włączone do przepływów diagnostycznych, w tym diagnostyki towarzyszącej, jako biomarkery do wykrywania obecności choroby, przewidywania wyników leczenia pacjentów lub monitorowania odpowiedzi na leczenie. W diagnostyce towarzyszącej cEV mogą być wykorzystywane do identyfikacji i śledzenia pacjentów w czasie, którzy mogą odnieść korzyści z określonego leczenia lub do przewidywania oporności na leczenie.

Dynamiczna ocena biomarkerów krążących EV może być używana do kierowania długoterminowymi decyzjami klinicznymi. W konkretnym przypadku miRNA pochodzących z EV, ich kwantyfikacja mogłaby być wdrożona w praktyce klinicznej jako uzupełnienie analizy biopsji guza opartej na PD-L1 w celu podejmowania decyzji terapeutycznych.

Jakie są ograniczenia tego badania? Po pierwsze, jest to badanie jednoośrodkowe z małą liczbą pacjentów z NSCLC, co może ograniczać możliwość uogólnienia wyników. Większa, wieloośrodkowa kohorta walidacyjna pacjentów zapewniłaby bardziej solidne wyniki i zwiększyła moc statystyczną analizy. Po drugie, czynniki zakłócające (np. historia palenia, status KRAS/EGFR) nie zostały w pełni dostosowane ze względu na małą wielkość próby. Ponadto, badanie to podkreśliło, że niektóre miRNA są zaangażowane w odpowiedź na pembrolizumab, ale nie zidentyfikowało mechanizmów, przez które wpływają one na odpowiedź na terapię. Potrzebne są badania funkcjonalne, aby potwierdzić biologiczny związek między miRNA a szlakami NSCLC.

Mimo tych ograniczeń, wiele danych dotyczących związku między ekspresją miRNA a cechami klinicznymi było statystycznie istotnych, co jest bardzo zachęcające. Dla translacji klinicznej kluczowe będzie potwierdzenie tych wyników w dużej kohorcie walidacyjnej.

Czy w przyszłości analiza miRNA z cEV stanie się rutynowym narzędziem w diagnostyce i monitorowaniu leczenia NSCLC? Trwają już różne badania kliniczne wykorzystujące biopsję płynną i miRNA w raku płuca (NCT04529915, NCT04182893, NCT03108677). W szczególności trwające badanie kliniczne (ClinicalTrials.gov identyfikator: NCT04427475) ma na celu przewidywanie odpowiedzi na immunoterapię przy użyciu egzosomów PD-L1 i ich miRNA w NSCLC.

Odkrycie wysoce czułych i dokładnych nieinwazyjnych biomarkerów za pomocą biopsji płynnej EV może być obiecującym podejściem w NSCLC. Analizy cEV i/lub ich specyficzne cechy molekularne powinny zostać włączone do badań klinicznych jako testy diagnostyczne lub do identyfikacji stadium/podtypu oraz jako testy diagnostyki towarzyszącej w celu oceny nowych środków terapeutycznych, kierowania podejmowaniem decyzji terapeutycznych i monitorowania odpowiedzi na terapię.

Czy ta metoda może zrewolucjonizować podejście do leczenia NSCLC? Czas pokaże, ale wyniki tego badania z pewnością otwierają nowe perspektywy w personalizacji terapii dla pacjentów z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuca.

Podsumowanie

Badanie przeprowadzone we włoskim ośrodku IRCCS CROB przedstawia przełomowe odkrycie w diagnostyce i leczeniu niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC). Naukowcy wykazali, że analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) i zawartych w nich mikroRNA może skutecznie przewidywać odpowiedź na immunoterapię pembrolizumabem. W badaniu zidentyfikowano kluczowe miRNA (miR-181b, miR-106b i miR-451a), których poziomy były znacząco wyższe u pacjentów nieodpowiadających na leczenie. Pacjenci z niską ekspresją tych miRNA wykazywali dłuższy czas przeżycia wolny od progresji. Szczególnie istotny okazał się miR-106b, którego niski poziom wiązał się z 66% redukcją wskaźnika śmiertelności. Metoda ta, jako nieinwazyjna biopsja płynna, może stanowić alternatywę dla tradycyjnych biopsji tkankowych, oferując kompleksową ocenę stanu choroby i umożliwiając lepszą personalizację leczenia. Mimo ograniczeń wynikających z małej grupy badawczej, wyniki są obiecujące i mogą prowadzić do rewolucji w podejściu do diagnostyki i leczenia NSCLC.